PhD Orapint Jintasataporn, Departamento de aquicultura da Universidade de Kasetsart ,Bangkok, Tailândia, 2014

A Síndrome da Mortalidade Precoce (EMS), também conhecida como Síndrome da Necrose Aguda do Hepatopancreas (AHPNS) é uma doença perigosa causada pela bactéria Vibrio parahaemolyticus. Desde o primeiro caso de EMS registrado na China em 2009, a doença se expandiu para o Vietnã, Malásia, Tailândia e México, causando perdas anuais de milhões de dólares. Os surtos de EMS normalmente ocorrem dentro dos primeiros 30 dias depois da reprodução dos camarões em um viveiro novo, e a mortalidade pode passar de 70%.

A doença é transmitida via oral e coloniza o aparelho gastrointestinal do camarão.  Ele gera uma toxina que causa a destruição do tecido e deficiência do órgão digestivo dos camarões, conhecido como Hepatopancreas. O objetivo deste teste foi avaliar o efeito do ImmunoWall® como aditivo capaz de reduzir o impacto nos camarões brancos jovens  (Litopenaeus vannamei) infectados pela bactéria Vibrio parahemolyticus, agente da EMS.

Para o teste, foram realizados 3 tratamentos:

1. Alimento comercial padrão para camarões brancos.
2. Alimento comercial com 5kg de ImmunoWall por tonelada de alimento.
3. Alimento comercial com 10kg de ImmunoWall por tonelada de alimento.

Camarão branco saudável – Os camarões PL 8 foram adquiridos de um viveiro comercial da província de Chachoengsao. Os camarões se adaptaram durante 5 dias antes de serem inseridos nos tanques de tratamento prévio no início do teste. Os camarões PL12 foram incluídos em um aquário de cristal de 100L, com salinidade de 20 ppt. A densidade de população dos animais de teste foi de 180 camarões PL12 por aquário (360ind./m²). A frequência de alimentação foi de 4 vezes ao dia, às 7:00, 11:00, 15:00 e 19:00.

A composição do alimento será detalhada na Tabela 1. A composição proximal do alimento de teste, como a umidade, proteínas, lipídeos, fibras e cinzas, foram analisadas como descrito pela AOAC (2000).

Tabela 1: Composição da dieta experimental

Materiais	Controle	ImmunoWall® 0.5%	ImmunoWall® 1.0%
Farinha de peixe, atum	25	25	25
Farinha de camarão	10	10	10
Farinha de lula	8	8	8
Farinha de trigo	29.3	28.8	28.3
Farinha de soja 45%	10	10	10
ImmunoWall®	0	0.5	1.0
Glúten de trigo	12	12	12
Óleo de peixe – Atum	0.5	0.5	0.5
Óleo de soja	0.5	0.5	0.5
Óleo de fígado de lula	0.5	0.5	0.5
Lecitina de soja	1	1	1
Metilo de carbamida	0.7	0.7	0.7
Pré-mistura de vitaminas minerais	2.5	2.5	2.5
Total	100	100	100
Composição proximal segundo AOAC (2000)
Umidade (%)	6.82	6.59	6.69
Proteína (%)	46.53	46.13	46.58
Lipídeo (%)	5.11	5.52	5.20
Fibra (%)	1.87	1.95	1.93
Cinza (%)	10.91	10.78	10.92
Cálcio	2.38	2.35	2.56
Fósforo (%)	1.37	1.46	1.40
Energia bruta/kg	4706.53	4716.68	4712.31

Temperatura e Tolerância ao estresse da salinidade

Os camarões foram deslocados para o estudo da tolerância ao estresse a uma temperatura de 35º. Cada tratamento foi repetido 4 vezes e foram utilizados 10 camarões por repetição. A temperatura em condições de teste aumenta gradativamente até 35ºC, e é controlada nesta temperatura. A taxa de mortalidade foi registrada diariamente durante 10 dias.

A tolerância ao estresse da salinidade foi realizada a 35 ppt. Os camarões foram deslocados para a unidade de teste e foram mantidos nestas condições. Cada tratamento foi repetido 3 vezes e foram utilizados 15 camarões por repetição. A taxa de mortalidade foi registrada diariamente durante 10 dias.

Combate à doença

Depois dos 30 dias a partir do período inicial, os animais de teste de cada tratamento foram transferidos ao combate no aquário (20 ind.). Cada tratamento foi repetido 4 vezes. As bactérias virulentas Vibrio parahaemolyticus foram combatidas através de tratamento por imersão para determinar a capacidade de resistência dos camarões contra estas bactérias patogênicas.

Cultivo de Vibrio parahaemolyticus

Um dia antes do combate, se cultivou Vibrio parahaemolyticus em caldo nutritivo com 1,5% de Na Cl (w / v). Trinta horas depois do cultivo, o caldo foi centrifugado para obtenção das células das bactérias. O agente patogênico foi lavado 2-3 vezes e ajustado a 10¹² antes do uso.

Tratamento por imersão

O teste de combate do Vibrio parahaemolyticus foi estudado através do tratamento por imersão em condições normais e sob condições de estresse por salinidade, um dia antes do combate.

Foram selecionados aleatoriamente oitenta camarões de cada tratamento, os quais foram transferidos ao aquário de 50L, com nível de água de 20L e 20 ptt de água do mar em condições normais. O teste de combate foi repetido 4 vezes por tratamento, com vinte camarões por repetição. Os camarões foram submetidos ao combate através do tratamento de imersão, com uma dose de infecção de 1.0 a 2.9 x 10¹² CFU/mL. Durante o combate, houve forte circulação da água. A taxa de mortalidade foi registrada diariamente durante 10 dias, e o Vibrio spp foi contabilizado a partir do hepatopancreas de cada grupo depois de 5 dias de testes de combate através do método agár TCB, para confirmar o agente patogênico e a imunidade dos camarões contra as bactérias.

Para as condições de estresse por salinidade e teste de combate via imersão, foram transferidos 45 camarões de cada tratamento aos aquários de 50L, com nível de água de 20L e 5 ppt de água do mar. O teste de combate foi repetido 4 vezes por tratamento, com quinze camarões por repetição. Os camarões foram submetidos ao combate através do tratamento de imersão, com uma dose de infecção de 3,0 a 3,5 x 10¹² CFU/mL. Durante o combate, houve forte circulação da água. A taxa de mortalidade foi registrada diariamente durante 10 dias. O Vibrio spp foi contabilizado a partir do hepatopancreas de cada grupo depois de 5 dias de testes de combate através do método agár TCB, para confirmar o agente patogênico e a imunidade dos camarões contra as bactérias.

Este teste foi realizado em contexto completamente aleatório (CRD). Todos os dados foram analisados através de análise de variâncias (ANOVA). O teste de comparações múltiplas de Duncan foi utilizado para determinar as diferenças entre os tratamentos. As pesquisas foram realizadas no Laboratório de Nutrição e Alimentos Aquícolas do Departamento de Aquicultura da Faculdade de Pesca da Universidade de Kasetsart, Bangkok, Tailândia.

Resultados

A temperatura e a tolerância ao estresse por salinidade do camarão branco alimentado com diferentes dietas serão apresentadas nas Tabelas 3 e 4. Os resultados mostraram que não houve diferenças significativas (p>0,05) na mortalidade dos camarões expostos à estas temperaturas e ao estresse da salinidade durante 10 dias. As altas temperaturas de 25ºC geraram uma certa mortalidade durante os quatro primeiros dias, mas depois, os camarões se adaptaram à condição. Em relação ao estresse por salinidade, todos os camarões sobreviveram, o que significa que os camarões podem adaptar sua fisiologia à salinidade.

Tabela 3: Taxa de mortalidade acumulada (porcentagem) do camarão branco (Litopenaeus vannamei) sob teste de estresse por temperatura 35ºC.

Dia depois do combate	Controle	ImmunoWall® 0.5%	ImmunoWall® 1.0%	Valor -P
Taxa de Mortalidade (%)	60.00 a	57.50 a	47.50 a	0.816
Taxa de Sobrevivência (%)	40.00 a	42.50 a	52.50 a	0.816

Nota: ^a,b Os valores com letras distintas em uma coluna mostram diferenças significativas (P < 0.05).

Tabela 4. Taxa de mortalidade acumulada (porcentagem) do camarão branco (Litopenaeus vannamei) sob teste de estresse por salinidade a 35 ppt.

Dia depois do estresse	Controle	ImmunoWall® 0.5%	ImmunoWall® 1.0%	Valor -P
Taxa de Mortalidade (%)	0	0	0	……
Taxa de Sobrevivência (%)	100	100	100	……

Nota: Os valores em cada tratamento foram os mesmos. Não houve análise estatística.

As tabelas 5 e 6 são focadas no efeito do ImmunoWall® na resistência à doenças no camarão branco (Litopenaeus vannamei) através de tratamento de imersão Os resultados mostraram diferenças significativas (p <0,05) depois do combate com Vibrio parahaemolyticus sob condições normais e com estresse por salinidade.

Em condições normais (tabela 5), a taxa de mortalidade do grupo de controle foi maior (p <0,05) que a do grupo de camarões alimentados com ImmunoWall. A contagem de Vibrio spp no hepatopancreas do camarão, depois do combate, demonstrou que o grupo de camarões alimentados com 1% de ImmunoWall tinha capacidade de hemolinfa para defesa contra as bactérias virulentas, seguido pelo grupo alimentado com 0,5% de ImmunoWall e o grupo de controle, respectivamente.

Sob condição de estresse de 35 ppt, a mortalidade dos camarões depois do cobate por Vibrio parahaemolyticus  (Tabela 6) obteve diferenças significativas (p <0,05). Os camarões alimentados com ImmunoWall® mostraram baixo nível de mortalidade  (p <0,05). A contagem de Vibrio spp no hepatopancreas do camarão, depois do combate, demonstrou que o grupo de camarões alimentados com 1% de ImmunoWall tinha melhor capacidade de hemolinfa para defesa contra as bactérias virulentas do que o grupo alimentado com 0,5% de ImmunoWall® e o grupo de controle, respectivamente.

Tabela 5: Taxa de mortalidade acumulada (porcentagem) do camarão branco (Litopenaeus vannamei) combatido pelo tratamento de imersão com uma dose de Vibrio parahaemolyticus de 10¹²cfu/ml.

Dia depois do combate	Controle	ImmunoWall® 0.5%	ImmunoWall® 1.0%	Valor -P
Dia 1	0.0	0.0	0.0	…
Dia 2	6.3 a	2.5 b	0.0 b	0.003
Dia 3	11.3 a	6.3 b	2.5bc	0.001
Dia 4	15.0 a	6.3 b	5.0 b	0.008
Dia 5	18.8 a	6.3 b	6.3 b	0.004
Dia 6	18.8 a	6.3 b	6.3 b	0.007
Dia 7	18.8 a	7.5 b	6.3 b	0.010
Dia 8	18.8 a	7.5 b	6.3 b	0.010
Dia 9	18.8 a	7.5 b	6.3 b	0.010
Dia 10	20.0 a	7.5 b	6.3 b	0.004
Taxa de Mortalidade (%)	20.0 a	7.5 b	6.3 b	0.004
Contagem de Vibrio spp. (cfu/g)	2.6X104a	3.2 X103c	1.3 X103c	<0.001
Contagem de Vibrio spp (Log cfu/g)	4.41a	3.50c	3.12d	<0.001

Nota:^a,b Os valores com letras distintas em uma coluna mostram diferenças significativas (P < 0.05).

Tabela 6: Taxa de mortalidade acumulada (porcentagem) do camarão branco (Litopenaeus vannamei) combatido pelo teste de salinidade a 35 ppt e pelo tratamento de imersão com uma dose infectada de Vibrio parahaemolyticus de 10¹²cfu/ml

Dia depois do estresse	Controle	ImmunoWall® 0.5%	ImmunoWall® 1.0%	Valor -P
Dia 1	51.11 a	28.89 b	24.44 b	0.020
Dia 2	66.67 a	42.22 b	35.56 b	0.020
Dia 3	73.33 a	48.89 b	40.00bc	<0.001
Dia 4	82.22 a	53.33 b	44.44bc	<0.001
Dia 5	86.67 a	53.33 b	46.67 b	<0.001
Dia 6	93.33 a	55.56 b	48.89 b	<0.001
Dia 7	95.56 a	55.56 b	48.89 b	<0.001
Dia 8	95.56 a	55.56 b	48.89 b	<0.001
Dia 9	95.56 a	55.56 b	48.89 b	<0.001
Dia 10	95.56 a	55.56 b	48.89 b	<0.001
Taxa de Mortalidade (%)	95.56 a	55.56 b	48.89 b	<0.001
Contagem de Vibrio spp. (cfu/g)	9.6 X106a	2.5 X106bc	3.2 X105d	<0.001
Contagem de Vibrio spp (Log cfu/g)	6.98a	6.38b	5.43d	<0.001

Nota:a,b Os valores com letras distintas em uma coluna mostram diferenças significativas (P < 0.05).

 Conclusão

O ImmunoWall® mostrou ser muito eficaz na redução da mortalidade dos camarões expostos ao estresse de temperatura, alta salinidade, e imersão com Vibrio parahaemolyticus, agente transmissor do EMS.

Os melhores resultados foram obtidos com ImmunoWall® para ambos os níveis de inclusão associados à alta salinidade (35 ppt). Como o Vibrio parahaemolyticus é uma bactéria halofílica, que se desenvolve e reproduz melhor em meios com alta salinidade, o ImmunoWall® pode controlá-lo mediante o aumento de atividade de imunização, melhorando a sobrevivência dos camarões em 50% se comparado com outras dietas sem o uso deste aditivo.